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ELISpot Part 3——ELISpot的对照设置及不同的刺激物简介

作者:admin信息来源:达科为日期:2018年06月15日打印字体:  
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Hello,大家好!间隔这么久,ELISpot又和大家见面了。。前面两期小达君已经和大家分享过ELISpot的简介,以及T细胞和B细胞ELISpot检测原理,本期ELISpot会和大家介绍如何来设置ELISpot的对照,以及刺激物的分类。是不是用坐地铁、坐公交的无聊时间跟着小达君一起来了解了解呢~~~


酶联免疫斑点(Enzyme-Linked Immunospot Assay, ELISpot)技术是当今世界上检测生物体细胞免疫水平的最佳技术。它集高灵敏度、高可信度、高通量、单细胞水平、功能性检测与低成本等诸多优点于一身,在国内外免疫学界获得了高度的认可和广泛的应用,成为主流免疫学检测技术之一。一次成功的ELISpot实验需要考虑的因素太多,比如:对照如何来设置,用何种刺激物来刺激,选择哪种细胞、哪种板子、哪种显色系统,这些都是我们要考虑的。因为篇幅有限本次小达君不能一一向大家介绍今天我们就先来看看对照的设置以及刺激物的选择吧~~~



对照的设置

ELISpot对照的设置不仅与实验目的相关,还与选择的细胞类型也有紧密的联系。一次严谨的ELISpot实验通常需要设置以下三种对照:

 


阳性刺激物

刺激物的种类与质量也直接关系到ELISpot结果的好坏。一方面,细胞状态再好,如果刺激物不能形成有效的刺激,那也不会出ELISpot斑点;另一方面,如果刺激物不纯,即使刺激出了斑点,也不见得是我们想要的斑点,反而会造成误解,得出错误的实验结论。

阳性刺激物通常包括两大类:非特异性刺激物特异性刺激物


图:ELISpot阳性刺激物分裂


非特异性的刺激物可以激活几乎所有的淋巴细胞,使之分泌各种细胞因子。通常是有丝分裂原,比如植物凝血素(PHA),伴刀豆蛋白AConA),离子酶素/佛波酯(Ionomycin/PMA),细菌脂多糖(LPS,美洲商陆PWM等等。


特异性刺激物通常包括三类T细胞表位肽、重叠多肽库和蛋白质。


² T细胞表位肽

T细胞表位肽是最好的特异性刺激物。这些多肽不需要APC的内化和加工,可以直接被呈递给T细胞。由于每一条T细胞表位肽都有相对应的MHC II分子,代表了一种特异性的细胞免疫,因此不确定因素少,实验结果非常明确。

T细胞表位肽虽好,但是使用限制很多,我们必须对抗原的T细胞表位有深入的研究和了解,这样才能去合成。另外,每一条T细胞都严格地受到相应的MHC II基因型的限制,检测对象的基因型要匹配才可能会有反应。


² 重叠多肽库

重叠多肽库策略属于数学上的穷举法:在不知道T细胞表位肽位置信息的情况下,也不知道检测对象MCH基因型,把所有可能的多肽都合成出来这种办法虽然繁琐费用高,但是效果还不错。

但它也有自身的一些局限,比如: 重叠多肽比T细胞表位肽要长一些,它不能直接被APC呈递,而是像蛋白质一样需要完整的内化、加工过程。所以以此作为刺激物,孵育时间比用T细胞表位肽要长一些。 合成出的多肽质量也会直接影响实验结果,公司合成多肽是根据纯度收费的。原则上ELISpot刺激物的纯度越高越好,但是考虑到实际性价比,90%的纯度是比较合理的。


² 蛋白质

蛋白质作为ELISpot刺激物,优点缺点参半。其优点在于:蛋白质包含了所有的T细胞表位肽信息,可以不必考虑MHC的基因型相对廉价。

但相比人工合成的多肽,蛋白质的纯度难以保证这里所指的纯度有两层含义 杂蛋白杂蛋白会有一些非特异性的刺激,造成实验孔的图像背景加深。 内毒素。内毒素会显著的刺激细胞,产生非特异性的斑点

表:部分刺激物浓度/细胞数目/孵育时间


Mabtech公司是世界上最早推广ELISpot技术应用的公司之一,除提供多种属、多指标的ELISpot试剂盒外还提供包括阳性刺激物在内的各类辅助试剂


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