ELISPOT Part 6----PVDF板的乙醇活化

ELISpot底板材质的改进

自1983年ELISPOT技术创立之初，检测底板使用的是普通塑料板，但由于塑料板的蛋白吸附能力差，实验的灵敏度有限，因此也限制了ELISpot技术的发展。1985年，Moller SA和Borrebaeck CA将硝酸纤维素膜作为底板，引入ELISPOT中用于检测分泌抗体的阳性B细胞，获得了远优于塑料板的结果。

不过硝酸纤维素（包括醋酸纤维素）也有自身的不足。由于它是天然纤维素经过人工酯化后获得的，纤维排列不规则，膜表面平整度差，导致表面形成的斑点外形破碎，高低错落，并且边缘弥散。另外，纤维素还存在机械承受力差，化学稳定性差，不利于长时间保存等缺点。

1995年，荷兰Utrecht大学免疫研究所的Schielen P团队把一种更优于硝酸纤维素膜的PVDF膜引入了ELISPOT检测中。PVDF是完全人工合成的，可以控制其纤维的长度与排列方式，从而获得几乎完美的膜结构。相比硝酸纤维素膜，PVDF膜具有更优的蛋白吸附性质，更加均匀的膜结构以及更加精细的显色条带分辨率。因此，PVDF的引入是继硝酸纤维素膜之后，ELISPOT底板材料的又一次重大突破。至今，除了BD公司还在沿用硝酸纤维素膜板外，其余全球所有的ELISpot试剂公司都用PVDF膜取代了硝酸纤维素膜。

PVDF膜的乙醇活化

由于PVDF膜是疏水性的，因此在使用前须用乙醇润湿后才能使用。酒精活化的PVDF膜板可以显著强化斑点的清晰度和可读性，增加斑点数量，提高ELISPot检测的灵敏度。

乙醇活化PVDF膜的快速指南

■乙醇活化—乙醇的浓度和加入的时间是关键

☆MSIP和IPFL板：每孔加入15 µl 35%的乙醇溶液，润湿时间不超过1 min；

☆MAIPSWU板：每孔加入50 µl 70%的乙醇溶液，润湿时间不超过2 min；

■板子的清洗：每孔加入200 µl的无菌水进行清洗，重复5次。

■加入包被抗体：每孔加入100 µl PBS稀释好的包被抗体，4℃包被过夜。

乙醇活化PVDF膜的注意事项：

■未润湿的PVDF膜是洁白，不透明的；经乙醇润湿后，颜色变暗，呈半透明状，很容易观察二者的区别。

■加乙醇时，枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方，注意枪头不要刺到PVDF膜。

■ 若加入的乙醇挂在孔壁上，盖上板盖，轻轻叩击，让乙醇顺势滑落。乙醇一旦接触到PVDF膜，就会在表面张力和毛细作用下迅速浸润整块膜，使得膜的颜色和透明度发生变化。

■乙醇加入的体积是经过优化的，请勿随意加大或减少用量。

■膜在润湿后避免过长时间的孵育，因为酒精的挥发会导致膜的高疏水性。

■预湿后的乙醇必须被有效的清洗掉，因为残留的乙醇会干扰斑点的形成。

为方便中国客户的学习，Mabtech厂家专门在优酷上传了《酶联免疫斑点技术(ELISpot)，PVDF板的乙醇活化》的操作视频，小伙伴们可以更清晰的学习到PVDF膜的活化操作哟！

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