在常规的ELISpot实验中，每个实验孔只能检测一种细胞因子。借助FluoroSpot就可以实现在一个孔内同时检测两种或两种以上的细胞因子或抗体。FluoroSpot拥有ELISpot的灵敏度，并且能够同时分析几种分泌物。这种高度灵敏的细胞分析方法相对稳定，易于操作。并且适合于单个检测和大规模筛选实验。荧光系统能同时检测多种分析物，Mabtech以此为依据研发出了高品质的双色和三色荧光FluoroSpot试剂盒。

• 优势一：FluoroSpot具有灵敏度高，操作简便，应用范围广等优点。

• 优势二：FluoroSpot能够生成更多的数据，节省时间。与免疫斑点相比，使用的细胞和抗原均较少。

FluoroSpot 原理

FluoroSpot能够分析抗原特异性的多功能T细胞，例如，IFN-γ和IL-2的分析。三明治夹心结构在荧光斑点中得以应用，不同特异性的单克隆捕获抗体混合物被包被于96孔板的PVDF膜上，生物素标记的检测抗体识别一种分泌物，tag标记的检测抗体识别其它的分泌物来实现双色或三色细胞因子分泌细胞的检测。检测通过带有特定荧光基团的共轭试剂放大信号斑点，可用自动读板器进行分析。

△双色FluoroSpot原理图

△三色FluoroSpot分析 能够更容易的区分T细胞中不同的细胞因子

三色 FluoroSpot分析总共可以显示7个亚群：3个单染的细胞因子，3个双染的细胞因子，1个三色的细胞群。图像显示的是一个三色FluoroSpot分析结果。用一组病毒肽（CEF）刺激人的外周血单个核细胞（PBMC），分别用FITC标记IFN-γ、CY3标记IL-2和CY5标记TNF-α。Overylay展示的是三个指标叠后得到的结果。

用途

FluoroSpot用途广泛，并且同样适用于单个检测和大规模筛选。三明治夹心法结合荧光基团标记的检测试剂能够对同一个孔中两个或两个以上的分析物进行分析。

（一）T-cellFluoroSpot--抗原特异性T细胞检测的理想方法

通过分泌单，双和三色细胞因子分析划分功能性T细胞亚群在许多不同的研究领域均引起极大的兴趣。FluoroSpot可用于疫苗开发，主要用于检测和分析疫苗特异性免疫应答。在癌症研究中，FluoroSpot可用于，例如监测肿瘤浸润淋巴细胞或通过同时分析IFN-γ和颗粒酶B的分泌，以提供细胞毒性T细胞反应更直接的评估。Mabtech公司提供了各种不同的荧光斑点试剂盒用于单，双和三色分析物的T细胞的分析，其中IFN-γ可单独分析或与几个不同的分析物同时进行分析。

△HumanIFN-γ/IL-2双色FluoroSpot

图为细胞受PPD（纯化蛋白衍生物）刺激分泌IFN-γ和/或IL-2的双色荧光斑点分析。结果显示在166个分泌IFN-γ的T细胞中，有114个细胞也能分泌IL-2。FITC(IFN-γ)和Cy3(IL-2)的图像叠加后的斑点代表该细胞同时分泌这两种细胞因子。

（二）B-cellFluoroSpot--确定分泌抗原特异性抗体细胞的总数

FluoroSpot可实现分析同一个孔中不同免疫球蛋白或亚型的表达情况。其主要应用的领域包括各种疾病和由免疫接种引起的B细胞免疫应答反应。例如，IgG、IgA和IgM的抗原特异性分泌物，可在接种疫苗前后进行检测。Mabtech公司提供双色FluoroSpot试剂盒用于检测人的IgG/IgA和IgG/IgM，以及三色FluoroSpot的试剂盒同时检测 IgG/IgA/IgM。

（三）其他类型的细胞

FluoroSpot还能够用于树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞的研究中，该检测可以根据细胞因子不同的分布描绘不同的亚群。

注：数据分析FluoroSpot要使用配备有测定不同荧光基团的特定滤光片的自动读板机。

☆Mabtech公司研发了能够用于人、小鼠和非人灵长类来源样本的FluoroSpot试剂盒

具体产品如下：