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NATE拍了拍你,快用我提高转染效率~

作者:admin信息来源:达科为日期:2020年07月10日打印字体:  
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为什么转染效率低?

真核细胞转染过程中,外源核酸(如质粒DNA)进入细胞会遇到一些阻碍,一方面胞质DNA和RNA感受器(如RIG-I样受体,cGAS和炎症小体)会识别这些外源核酸, 另一方面外源核酸需要避开防御性机制(如自噬),因此外源核酸引起的信号级联激活通常会导致细胞转染效率降低和细胞活力降低。

如何提高转染效率?

NATE™是一款专门开发的核酸转染增强剂,可抑制许多核酸感应途径,从而保护外源DNA并促进其表达,用于提高难转细胞(如THP-1和RAW 264.7)的转染效率。与常用的转染试剂(如GeneXPlus,Lipofectamine®LTX和jetPRIME®)、物理方法(电转)以及慢病毒转染等兼容,只需在转染步骤前添加NATE™孵育30分钟,即可进行后续转染操作。

NATE怎么用?


准备分装的储存液(100 x NATE)(????以下为单瓶的准备步骤)


  • 向每瓶加入250ul DMSO进行溶解;

  • 剧烈涡旋确保薄膜完全溶解;

  • 向瓶中加入250ul无菌去内毒素水再次涡旋;

  • 分装置于-20°C保存。

稳转/瞬转实验使用NATE


(以下是在THP-1和RAW264.7细胞的瞬时和稳定转染中使用NATE的详细步骤,该方案适用于多种瞬时和稳定转染,包括不同大小的细胞培养板(6/12/24孔板),不同的转染方法和不同大小的质粒)

a、细胞准备

1. 如往常一样,在完全培养基中准备待转染的细胞(如THP-1或RAW264.7)。

  • RAW264.7转染注意事项:在加入NATE和开始转染步骤前,必须将细胞接种24h;

  • THP-1转染注意事项:转染效率取决于细胞的培养方式。每三天将细胞分为起始密度至0.5 x 10^6 cells/ml;

  • THP-1稳转注意事项:建议在转染过程中使用丰富培养基(即在普通培养基中加入20%血清、20%条件培养基、丙酮酸钠、非必需氨基酸和抗氧化剂);

b、添加NATE

2. 添加100 x NATE储存液至终浓度为1 x。添加量(添加1%)根据使用的平板和培养基体积而变化。

  • 注意:例如,在转染中使用1mL细胞培养基时,向细胞加入10 ul NATE。

3. 轻晃培养板使NATE均匀分布到细胞中。

4. 在正常细胞培养条件下孵育至少30分钟。

c、转染

5. 按照转染试剂说明书进行转染操作(包括聚合物或脂质体转染,病毒转染或电转)。

  • 注意:如果转染方法要求在转染后短时间内更换培养基,必须在新培养基中重新加入NATE。

6a. 对于瞬时转染:在适当条件下培养24-48h,以便进行基因表达的检测。

6b. 对于稳定转染:在转染后2-4天使用抗生素进行筛选。延迟筛选可使细胞状态从转染中恢复。

  • THP-1细胞稳转注意事项:当选择效率开始提高时,建议使用适当试剂盒去除死细胞。

转染使用举例

(下表是使用NATE转染THP-1或RAW264.7细胞的示例)



相关筛选抗生素


更多信息请浏览:

www.bio-city.net                  

www.invivogen.com

常见问题

Q1

NATE包装瓶里看不到有东西是正常的吗?

A1:产品量较少且是半透明薄膜形式,几乎看不到,建议先进行离心再溶解,最好不要打开瓶子的乳胶塞,可以打开铝盖后使用注射器将DMSO注入瓶内进行溶解。

Q2

NATE能否只用DMSO溶解?无菌无内毒素水可用什么替代?

A2:说明书溶解条件是经过优化的,建议按照说明书步骤进行溶解(先:DMSO;后:无菌去内毒素水);可使用医用级注射用水替代。


InvivoGen 1977年成立于法国,是法国最早的生物科技公司。公司成立的初期阶段主要提供细胞培养相关试剂,如抗支原体、细菌、真菌污染的抗生素以及基因筛选抗生素(Blasticidin, Puromycin, Hygromycin B, G418, Zeocin)。随着天然免疫研究热点的兴起,InvivoGen于2000年开始致力于天然免疫相关产品的研发和生产,并成为全世界最优质、最专业的天然免疫相关产品生产商。InvivoGen为天然免疫研究提供一整套研究方案,包括不断更新的模式识别受体(PRRs)激动剂和拮抗剂,PRRs报告基因细胞以及天然免疫信号通路的诱导剂和抑制剂等。


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