l 多细胞因子的检测

通常的ELISPOT实验中，每个试验孔只检测一种细胞因子。如果要在一个ELISPOT孔内同时检测两种细胞因子，可包被两种抗体以捕获两种细胞因子，然后用两种不同的酶联以及显色剂体系（比如辣根过氧化物酶体系与碱性磷酸酶体系）显出两种颜色斑点。

早在1988年，Cecil C. Czerkinsky就提出并且实现了这种想法（Czerkinsky C et.al,. 1988b）。但双色ELISPOT有一个与生俱来的弱点，那就是双色斑点分离的问题。斑点的混合色属于物理学上“颜料的三原色”问题，两种不同颜色的颜料如果以不同的比例混合，会出现一系列不同的表观颜色。如同画家手上的调色板一样，技艺娴熟的画师可以用两种颜料调出几千种颜色！这其中细微的差异，人的肉眼有时候都难于判断，更何况全自动读板仪！所以在双色ELISPOT斑点识别上，总会有些混色斑点无法被很好的识别并分类。

l 荧光斑点 FluoroSpot

为了解决这个难题，人们想到用荧光检测ELISPOT的方法（Ruedl C et. al., 1994; Sarawar SR et. al., 1994）。不同颜色的荧光混合在一起，只要加一张滤光片，就可以精确的滤出目标荧光，而遮蔽掉其它颜色荧光，荧光之间可以互不干扰。这对于双因子，甚至多因子ELISPOT检测都是十分理想的手段（Gazagne A et. al., 2005）。

荧光ELISPOT检测方法理论上很容易实现，但在具体的实验检测中还有待进一步的研究发现。随着同时检测的细胞因子的增多，底板吸附蛋白的能力也要成倍提高。PVDF膜作为目前吸附能力更强的膜，也只是刚刚能满足同时包被吸附3种包被抗体的要求。由于荧光素直接偶联在抗体或者亲和素上，缺乏酶催化底物的放大作用，所以灵敏度还无法和化学显色的ELISPOT方法比较（Gazagne A et. al., 2005）。此外，硝酸纤维素膜自身在激发下就会发荧光，所以不适合做荧光ELISPOT底板材料。PVDF膜也有自身发荧光的问题，虽然不像硝酸纤维素膜那样严重，但是也会造成背景升高，信噪比下降的问题（Gazagne A et. al., 2005）。

面对荧光斑点的挑战，荷兰U-Cytech公司已经开发出新一代的荧光底板介质Hydrogel™，再一次走在了世界前列。Hydrogel™具有三维结构，彻底解除了二维底板蛋白吸附能力不足的制约，也解决了包被量不足导致的荧光强度和灵敏度低的问题，足以满足同时包被10种包被抗体的要求！另外Hydrogel™与抗体是共价交联的方式，结合牢固，可以耐受比较剧烈的洗涤方式，以彻底洗去杂蛋白的荧光干扰。Hydrogel™本身没有任何荧光背景，所以可以获得极高的荧光信号与背景噪音的对比。

荧光多细胞因子检测是ELISPOT技术未来的一个发展方向。 由于这项技术是如此的具备革命性与颠覆性，所以那时连“ELISPOT”这个词都要修改为“Fluoro Spot”。

综上所示，技术进步的潮流不可挡。未来ELISPOT的操作会更简单，功能会更强大，用途也会更广泛。