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ELISA实验中的FAQ（二）
1、整体OD值过高，标准品OD值过饱和
遇到这样的情况，首先检测标准品的稀释情况，确保标准品浓度的正确稀释。在标准品确保无误后，若孔板显色明显，可参考以下原因及解决方法：
显色时间过长或孵育温度错误
解决方法：根据试剂说明书提供的孵育温度，适当缩短Avidin-HRP或显色底物的孵育时间。
洗涤次数不够
解决方法：严格按照说明书的洗涤次数进行
试剂配制不正确（如检测抗体、酶等稀释度是否正确）
解决办法：严格按照试剂说明书进行试剂的配制
混用其他试剂盒试剂
解决方法：使用本试剂盒内配套试剂，不同品牌及不同批次间的试剂之间可能存在不匹配现象
使用污染的去离子水或者buffer稀释试剂盒中的试剂
解决方法：使用新鲜的无污染的去离子水或者buffer稀释试剂
2、标准品OD值正常但样本OD值过高
样本浓度过高
解决方法：稀释样本，进行预实验确定样本稀释倍数
3、试验结果空白背景高
洗板不干净
解决方法：充分洗涤，彻底拍干；洗板要防止交叉污染；浓缩洗液准确配制；枪尖尽可能一次性使用；加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染；浓缩洗涤液如有结晶则应让结晶于室温全部溶解后再量取稀释
显色液变质或者试剂过期
解决方法：检查试剂盒有效期，如果发现显色液颜色变化或试剂过期，请勿使用
试剂稀释有误，如加酶的浓度过高
解决方法：严格按说明书所示稀释倍数配制
蒸馏水受酶等污染
解决方法：使用新鲜蒸馏水
试剂混用
解决方法：不同批号试剂勿混用
培养箱温度超过37℃或反应时间过长
解决方法：校正培养箱温育温度或显色反应时间适当缩短
检测试剂加多
解决方法：确保试剂正确稀释或降低检测试剂的使用浓度
添加终止液后等候太长时间才进行读板
解决方法：添加终止液后10分钟内进行读板
抗体出现非特异性结合
解决方法：使用合适的封闭缓冲液，比如BSA或5-10%的正常血清。如果使用直接偶联的检测抗体， 则封闭缓冲液种类与一抗相同；如果使用偶联二抗，则种类与二抗相同。确保孔已经过预处理以防止非特异性附着。
高抗体浓度
解决方法：尝试不同的稀释度以优化结果
底物孵育在灯光下进行
解决方法：底物孵育应在黑暗中进行或遵循说明书操作
添加底物后会在孔中形成沉淀
解决方法：增大样品的稀释倍数或降低底物浓度
酶标板不干净
解决方法：清洗酶标板底部
4、实验结果白板
试验结果白板，而且阳性对照孔不显色，常见原因如下：
漏加或者误加试剂
解决方法：检查试验记录和剩余试剂。每次加液前均应核对标签
试剂过期
解决方法：使用有效期内的产品
洗板液配制中出现问题，如量筒不干净含HRP酶抑制物（叠氮钠等）
解决方法：使用干净的器皿，正确配制试剂
温育的时间或温度不够
解决方法：校正温育箱温度和调整合适的孵育时间
标准品失活或者丢失
解决方法：标准品正确保存、溶解和混匀
抗体失活或者丢失
解决方法：更换抗体或者提高抗体浓度
酶失活或者丢失
解决方法：把工作浓度的酶再稀释20－100倍，取5uL加入50ul的显色底物，终止后显色是否能达到1.0左右，此为酶的粗略估计。更换酶或者提高酶的浓度
显色底物失活
解决办法：加少量的工作浓度的酶，TMB是否很快显色检查，若不显色，则更换显色底物
5、标准品/样本复孔差异大
实验的标准曲线和测定的重复性差，这是典型的由测定操作引起的问题，常见原因如下：
加样本及试剂量不准；孔间不一致
解决方法：
①校正移液器，枪尖要配套，确保移液准确。
②重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近；
③重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性；
④样品稀释前应充分混匀；
⑤样本应保持新鲜无异常。
加样过快，孔间发生污染
解决方法：重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性；加样不要过快
加错样本
解决方法：检查记录和试剂，是否加错样本
加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区
解决方法：加样枪头不要贴壁
不同批号试剂盒中组分混用
解决方法：不同批号试剂盒中组分不可混用
温育时间、洗板、显色时间不一致
解决方法：检查时间是否一致
孔内污染杂物
解决方法：离心样品，排除杂物
试剂/样品没有混匀
解决方法：充分混匀样品和试剂
洗涤不符合要求，低于3次或者洗板不彻底
解决方法：严格按照说明书规定进行洗板操作
血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等
解决方法：待血清标本完全凝固后分离样本做试验
孔中有气泡
解决方法：确保读取酶标板前不存在气泡
边缘效应
解决方法：确保酶标板和所有试剂都处于室温
6、标准曲线梯度差
标准溶液配制不当
解决方法： 确认是否正确进行稀释
标准品复融不当
解决方法：打开前，短暂离心标准品；检查复融后是否有未溶解物质
标准品已降解
解决方法：按说明书推荐方式处理并保存标准品
曲线与标度不合适
解决方法：尝试使用不同标度绘制曲线，例如对数-对数、5-参数逻辑曲线拟合。
-线性图：一个坐标轴表示抗原的浓度，另一个表示读数。R2值在此通常用于确定拟合，数值大于0.99表示拟合非常好。然而，线性图往往会压缩曲线下端上的数据点，导致计算结果不准。
-半对数图：帮助抵消线性图引起的下端压缩。半对数图使用浓度的对数与读数的关系。这种方法通常会得到数据点分布更均匀的S形曲线。
-对数/对数图：为低到中浓度范围提供良好的线性。但范围的高点则容易失去线性。
-4或5参数逻辑（4PL或5PL）曲线：方法更复杂，考虑了其他参数比如说高值和低值，因此需要更为复杂的计算。4PL假设拐点周围对称，而5PL考虑了不对此的情况，通常更适合免疫分析。
如果您的软件允许，则4PL和5PL将适用于大部分ELISA校正标准曲线。如果您的软件不允许，则可选择是试用半对数或对数/对数图。
移液出错
解决方法：使用校准好的移液器和正确的移液方法。
标准品溶解方式不正确
解决方法：严格按照标签上说明的方法进行溶解，有些用试剂盒中buffer进行溶解，有些用蒸馏水或者去离子进行溶解等，以说明书为准
稀释方式不正确
解决方法：推荐在PP材质的EP管中用Dilution buffer稀释后加样
标准品被污染
解决方法：标准品溶解后不宜放置时间过长，在标准品稀释过程中请勿共用枪头，标识要清晰
出现特异孔
解决方法：剔除特异孔后进行标准曲线拟合
孵育时未加盖导致溶液挥发污染
解决方法：加封口膜或者加盖进行孵育
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