【流式学习】全光谱流式荧光素-PE/Fire700

   流式细胞术是生命科学领域尤其是免疫学和诊断医学研究中不可或缺的技术，由于其可进行单细胞水平的研究，并且兼具高通量和同时检测多个参数的特点，流式细胞术的应用越来越广泛。有了多色流式技术的加持和启发，生命科学的研究越来越深入。但是由于科学研究的深入，需要同时检测的指标越来越多，传统流式由于荧光渗漏和自发荧光导致通道数量受限，又没有太好的解决该瓶颈的方法，使得传统流式的发展速度缓慢无法满足日益深入的学科研究。

       为了解决这个问题，光谱流式的技术在借鉴传统流式技术的基础上应运而生，通过分析每个荧光素的光谱特征区别不同的荧光素，即使发射波长相似的荧光素如APC和AF647，由于其波形不同，在光谱流式中也能很好的解析开，可消除传统流式中荧光间补偿的困扰，另外通过对特异性光谱的分析可以方便的消除自发荧光信号的干扰。因此，光谱流式相对于传统流式来说可以同时检测更多的参数，那么适配光谱流式的荧光素的开发是这项技术发展的核心。

      今天我们介绍BioLegend推出的适用于光谱流式的一种新的荧光素---PE/FireTM700。

       PE/Fire700是BioLegend Fire系列的荧光素，该系列荧光素具有很好的稳定性，以及优秀的荧光亮度，PE/Fire700的荧光亮度指数可达到5（最高指数为5），适用于稀有亚群以及蛋白丰度较低的指标的检测。

PE/Fire700最理想的检测平台是光谱流式，比如Cytek® Aurora。

PE/Fire™ 700在光谱流式平台上的激发光谱（Excitation Spectra of PE/Fire™ 700）

PE/Fire™ 700在光谱流式平台上的发射光谱（Emission Spectra of PE/Fire™ 700）

       但是在一些高配的传统流式细胞仪如BD FACSymphony™上也是适用的，其稳定性要优于替代染料PE/Cyanine5.5。

       很显然，在传统的流式平台PE/Fire™ 700和PE/Cyanine5.5是不可以使用在同一个panel中的，但是在光谱流式中，两种荧光染料由于其光谱特性存在一定的差异，是可以区分开：

    在5激光Cytek® Aurora 光谱流式平台上，检测人裂红后外周血的CD4和CD19。PE/Fire™ 700-CD19和PE/Cyanine5.5-CD4共染方案与PE/Fire™ 700-CD19和PE-CD4共染方案得到了相似得阳性信号，说明在光谱流式平台PE/Fire™ 700和PE/Cyanine5.5是有可能在一个panel中共用的，但是配色方案可以更加优化。

PE/Fire™ 700光稳定性

       PE/Fire™ 700 和PE/Cyanine5.5标记的两种CD4抗体检测人PBMC，无论在避光条件下还是暴露在荧光的条件下，PE/Fire™ 700的稳定性要优于PE/Cyanine5.5（检测平台为5激光Cytek® Aurora 光谱流式）。

PE/Fire™ 700热稳定性

将PE/Fire™ 700标记的抗体分装后分别保存在4℃、22℃和37℃下。稳定性可以根据抗体的染色指数（staining index）和荧光补偿百分比来衡量，随着保存时间的延长，3种温度保存条件下光补偿百分数并没有发生改变，但是37℃的保存条件染色指数下降了约36%，22℃保存条件的染色指数下降了约12%，这主要是由于这两种保存条件下抗体的非特异性染色背景升高引起的（检测平台为5激光Cytek® Aurora 光谱流式）。

PE/Fire™ 700在固定剂中的稳定性

PE/Fire™ 700 和PE/Cyanine5.5标记的两种CD4抗体检测人裂红外周血，抗体孵育完成后在固定洗涤马上去检测条件下和过夜后的条件下，在5激光Cytek® Aurora 光谱流式平台检测，PE/Fire™ 700 在不同的实验方案中对多聚甲醛的固定具有稳定的抗性，表现出比PE/Cyanine5.5更优秀的稳定性，但是在磷酸化指标的检测方案中，PE/Fire™ 700荧光素的稳定性出现了一定程度的下降。